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La scienza dell’Ingegneria Tissutale cerca continuamente di trovare strategie più facili, più veloci e maggiormente predicibili per la rigenerazione di tessuti persi per eventi patologici o traumatici. Tra le diverse strategie di Ingegneria Tissutale oggi studiate per la rigenerazione di nuovi tessuti, le terapie cellulari risultano particolarmente promettenti. In odontoiatria questa e altre tecniche di Ingegneria Tissutale trovano applicazione pratica nella rigenerazione di osso, polpa dentale o mucosa cheratinizzata1 (figura 1).

pagni disegni-1Gli impianti dentali sono tra le protesi di maggior successo in medicina; fin dalla loro introduzione hanno permesso nuovi approcci terapeutici per pazienti affetti da diversi tipi di edentulia. Data l’estesa utilizzazione degli impianti in odontoiatria (l’Italia vanta il più alto indice di penetrazione al mondo), le terapie di rigenerazione ossea hanno assunto particolare importanza nelle tecniche di preparazione del sito implantare che sono spesso necessarie quando non sono presenti volumi ossei tali da garantire un corretto posizionamento dell’impianto.

La rigenerazione di un nuovo tessuto

In generale, la rigenerazione di nuovi tessuti richiede l’uso di bio-materiali che possono essere identificati in diverse categorie: impalcature (scaffolds), fattori di crescita e cellule.

Ognuno di questi elementi gioca un ruolo di fondamentale importanza nel processo di guarigione in fasi temporalmente interconnesse2. Nelle terapie rigenerative convenzionali le cellule devono raggiungere la zona dove il nuovo tessuto deve essere generato, migrando dalla periferia della sede di innesto. Gli scaffolds sono utilizzati sia come supporto alla migrazione cellulare sia come impalcature per la deposizione della matrice organica.

Diversi tipi di scaffolds sono comunemente introdotti nello studio odontoiatrico come ad esempio sostituti ossei da innesto.

La migrazione e la differenziazione cellulari sono regolate e stimolate da fattori di crescitache modulano l’attività cellulare e forniscono lo stimolo alle cellule a differenziarsi e produrre la matrice per lo sviluppo del tessuto. I fattori di crescita stimolano anche la produzione di segnali angiogenici che inducono la formazione di una nuova rete vascolare, essenziale per il funzionamento delle cellule quale fonte di nutrienti e ossigeno e quale via di rimozione dei cataboliti. I tentativi di integrazione di fattori di crescita in odontoiatria risalgono all’introduzione del plasma ricco di piastrine (PRP)3 e del plasma ricco di fattori di crescita (PRGF)4. Più recentemente fattori di crescita ricombinanti sono stati analizzati, inclusi il fattore di crescita derivato dalle piastrine (rh PDGF-BB)5-11 e le proteine morfogenetiche dell’osso (BMPs)12-14. Le tecniche di Terapia Cellulare forniscono un’ulteriore fonte di cellule nell’area di interesse. Invece di dipendere completamente dalla capacità delle cellule dell’organismo ospite per la rigenerazione di un nuovo tessuto e per la produzione di fattori di crescita, le cellule innestate sono pronte alla produzione di nuovi tessuti e permettono un rilascio costante di citochine durante le varie fasi della guarigione.

Terapia Cellulare

Due principali tipi cellulari sono utilizzati nell’ingegnerizzazione di un nuovo tessuto: cellule somatiche e cellule staminali. Durante il processo di differenziazione le cellule staminali mantengono la loro capacità di autorinnovamento ma perdono quella di differenziarsi verso diverse linee cellulari. Alla fine del processo di differenziazione, le cellule staminali unipotenti manterranno la capacità di autorinnovamento ma saranno capaci di differenziarsi verso un’unica linea cellulare. Da queste derivano cellule somatiche (ad esempio, muscolari, nervose, del sistema immunitario) che non hanno proprietà di autorinnovamento ma che possono comunque essere coltivate e utilizzate nell’ingegnerizzazione di nuovi tessuti.

Cellule somatiche

Cellule somatiche coltivate e rivolte alla costruzione di tessuti sono state studiate e testate in diverse branche della medicina contemporanea, ma solo recentemente queste strategie sono state utilizzate in parodontologia. Dogan et al. hanno trovato migliore rigenerazione ossea utilizzando cellule derivate dal legamento parodontale in difetti forcali creati artificialmente in relazione ai controlli15. Fibroblasti coltivati sono stati usati nel trattamento di insufficienze papillari interdentali con risultati soddisfacenti16. Un’equivalente di mucosa orale umana ingegnerizzata è stata assemblata con successo ex vivo da Izumi et al. e sembra essere un’accettabile sostituto per procedure di innesto intraorale nell’uomo17. McGuire et al. hanno paragonato l’efficacia di cheratinociti e fibroblasti neonatali con l’innesto di gengiva libera dimostrando che l’uso di tali cellule porta alla creazione di un’adeguata banda di gengiva cheratinizzata senza bisogno di ricorrere a un sito donatore18,19. Inoltre, Morelli et al. hanno scoperto che l’espressione di biomarkers associata all’angiogenesi in siti trattati con questo composto cellulare vivente è sovra-regolata in relazione agli innesti di gengiva libera durante le prime fasi di guarigione20. In una serie di case-reports Somerman et al. hanno dimostrato la possibilità di utilizzo di terapie cellulari con cementoblasti clonati21. Zhao et al. hanno trovato che il trapianto di cementoblasti clonati in carriers di acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA) porta alla riparazione di grandi difetti parodontali in un modello murino22. Jin et al. hanno mostrato che l’utilizzo di fibroblasti cutanei transdotti con il gene BMP-7 in difetti ossei parodontali promuove la generazione di nuovi tessuti, inclusi osso, legamento parodontale funzionale e cemento radicolare23. Queste strategie offrono prospettive nello sviluppo di terapie ottimali per la rigenerazione parodontale, tuttavia l’uso di cellule somatiche permette solamente la rigenerazione di tessuti ai quali le cellule innestate sono destinate; inoltre, la possibilità di ottenere rigenerazione è strettamente legata alle concentrazioni di cellule raggiunte nell’area di innesto.

Cellule staminali

Le cellule staminali, d’altra parte, mantengono la capacità di autorinnovamento attraverso divisione cellulare mitotica e possono differenziarsi verso diversi tipi di cellule specializzate (Tabella 1).

Schermata 2015-07-01 alle 15.21.43Uno dei benefici più importanti nell’utilizzo di certe popolazioni di cellule staminali è che una volta trapiantate nel sito di innesto possono differenziarsi in cellule strettamente osteogeniche così come in “cellule di supporto all’osteogenesi”. Tali cellule di supporto sono definite come cellule che non producono direttamente osso ma che generano strutture che facilitano questo processo (come ad esempio la rete vascolare). Un altro vantaggio concerne la capacità di autorinnovamento, che permette alle cellule di proliferare continuamente durante la guarigione fin tanto che i segnali del tessuto ospite lo richiederanno. È stato altresì ipotizzato che cellule staminali mesenchimali possano avere un ruolo nella prevenzione dell’infiammazione nel sito di innesto24 permettendo una più veloce rigenerazione tissutale.

Cellule stromali del midollo osseo

La fonte principale di cellule staminali utilizzata in medicina è costituita dallo stroma del midollo osseo contenente cellule stromali del midollo osseo (BMSC)25. Queste cellule sono anche dette cellule staminali mesenchimali (MSCs) e sono caratterizzate da una elevata capacità di autorinnovamento e dall’abilità di generare tessuto osseo, cartilagine, adipociti midollari, miociti e tessuto fibroso quando trapiantate in vivo.

Ognuno di questi tessuti può essere originato da una singola Unità Formanti Colonie fibroblastiche (UFC-F o CFU-F)26.

Lungo il percorso di differenziazione, stimoli differenziativi limitativi o induttivi possono portare a cellule caratterizzate da una minore capacità di autorinnovamento e da un maggior grado di differenziazione25; eppure questo percorso sembra essere reversibile in modo tale che un adipocita adulto possa de-differenziarsi a livelli di maggior capacità generative e poi differenziarsi verso il percorso osteogenico27.

Nonostante l’importanza di tali considerazioni, prenderemo in analisi principalmente cellule originate da Unità Formanti Colonie osteoblastiche (UFC-OB o CFU-OB).

Cellule osteoprogenitrici sottoposte a determinati stimoli entrano in mitosi e producono cellule che si differenziano in pre-osteoblasti e successivamente in osteoblasti. Diversi studi hanno confermato formazione ossea in localizzazioni ectopiche, dove erano state impiantate MSCs28. Questo potrebbe essere il risultato della capacità delle MSCs di stimolare la produzione di molecole osteoinduttive29.

In chirurgia maxillo-faciale, blocchi ossei allogenici impregnati di midollo osseo aspirato dalla cresta iliaca anteriore sono stati usati con successo nel trattamento di pazienti con creste alveolari severamente compromesse offrendo un’alternativa meno invasiva rispetto al prelievo di osso da una seconda sede chirurgica30. Un case report ha utilizzato MSCs isolate da aspirati di midollo dalla cresta in combinazione a plasma ricco di piastrine in difetti parodontali angolari e ha suggerito un possibile ruolo di questo composto cellulare in rigenerazione parodontale31.

Uno studio di Marei et al. ha trovato che impiantando uno scaffold poroso ingegnerizzato e innestato di BMSCs era possibile ottenere una migliore preservazione delle pareti alveolari rispetto ai gruppi controllo32. Trapiantate in un difetto osseo, le MSCs hanno dimostrato di rimanere nella sede di innesto contribuendo alla formazione ossea in qualità di cellule osteoblastiche differenziate. In questo studio, la rigenerazione ossea mediata da MSC è risultata maggiore rispetto ai gruppi controllo33.

Aspirati di midollo osseo freschi utilizzati come materiale da innesto nell’alveolo post-estrattivo hanno dimostrato riassorbimento osseo di grado minore in rapporto ai controlli34.

Il nostro gruppo ha recentemente valutato Tissue Repair Cells, un composto cellulare derivante da midollo osseo autologo coltivato utilizzando bioreattori automatizzati raggiungendo concentrazioni di cellule staminali non raggiungibili attraverso un semplice aspirato midollare (figura 2). Abbiamo scoperto che questo composto cellulare è capace di produrre una significativa concentrazione di citochine e che mantiene l’abilità delle cellule di differenziarsi in cellule endoteliali e produrre fattori angiogenici35. Il fondamento logico dietro l’uso di questo composto non è solamente relativo alla capacità di apportare MSCs in uno stadio di differenziazione precoce ma anche alla capacità di apportare cellule osteogeniche di sostegno che non producono osso direttamente ma ne facilitano la deposizione attraverso la creazione di strutture indispensabili al processo di rigenerazione (ad esempio, la rete vascolare). Inoltre, queste cellule sono state largamente caratterizzate dimostrando coefficienti medi di espansione delle concentrazioni cellulari di 234 per le cellule staminali mesenchimali CD90+ (Thy1), di 405 per le CD166+ e di 780 per le CD 105/166+36 e sono state utilizzate per oltre 12 anni nel trattamento di più di 300 pazienti senza che sia mai stato riportato alcun evento avverso relativo al trattamento.

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Ciclo di produzione delle Tissue Repair Cells. Il ciclo produttivo delle Tissue Repair Cells comincia dal prelievo di midollo osseo dalla cresta iliaca posteriore del paziente circa 14 giorni prima dell’intervento di innesto delle cellule. L’aspirato di midollo osseo viene separato dalla componente rossa e inoculato in una cassetta cellulare completamente chiusa e automatizzata dove le cellule saranno espanse usando un sistema di perfusione a passaggio unico. Dopo il completamento della fase di espansione (circa 12 giorni) il composto cellulare è caricato su uno scaffold e utilizzato come innesto per la rigenerazione ossea (da Klaiger et al. 2010, con permesso dell’American Academy of Periodontology).

Altre fonti di cellule staminali

Altre possibili fonti di cellule staminali sono state analizzate: quelle derivate dall’adipe (ASCs) hanno dimostrato di promuovere rigenerazione parodontale in vivo. Poiché aspirati di tessuto adiposo sono facilmente disponibili e il loro prelievo induce minima morbidità, le ASCs potrebbero essere utili in future tecniche di rigenerazione parodontale basate su terapie cellulari37.

Oltre che nel midollo osseo, è stato riportato che cellule staminali post-natali sono presenti in tessuti adulti quali il fegato, i muscoli, la polpa dentale (DPSCs) e il legamento parodontale (PDLSCs). Le MSCs esistono in vari tessuti dentali e possono differenziarsi in osteoblasti, adipociti e altri tipi cellulari con diverso rendimento38. Si è dimostrato che la criopreservazione di terzi molari è una metodica adeguata e con un buon rapporto efficacia/prezzo per la preservazione delle cellule MSC e che queste mantengono le loro caratteristiche di cellule staminali mesenchimali. Questa scoperta ha aperto la strada alla possibile costituzione di una banca di MSC con minimo bisogno di manipolazioni39.

Cellule staminali sono state isolate da polpa dentale di denti decidui e hanno dimostrato di mantenere la capacità di differenziarsi in osteoblasti e indurre la formazione di osso, dentina e polpa dentale40-42. Seo et al. sono riusciti a ottenere da legamenti parodontali criopreservati di denti decidui estratti cellule staminali post-natali con normali caratteristiche di cellule staminali del legamento parodontale43. Le cellule umane del legamento parodontale hanno la capacità di differenziarsi in cellule simili a cementoblasti, adipociti, e cellule formanti collagene capaci di generare strutture simili a cemento/legamento parodontale contribuendo alla riparazione dei tessuti parodontali44.

Recentemente, attraverso il trapianto di cellule progenitrici del legamento parodontale è stato dimostrato il principio di poter ottenere strutture ibride legamento-impianto dentale45,46. Perciò esiste un considerevole potenziale per l’uso di cellule staminali o di cellule progenitrici del legamento parodontale per formare in vivo tessuti parodontali duri e molli.

Attraverso manipolazione genetica un gruppo dell’Università di Kyoto è stato capace di riprogrammare cellule somatiche murine generando cellule staminali pluripotenti indotte (iPS cells) che sembrano essere completamente simili alle cellule staminali normalmente utilizzate47. Lo stesso gruppo è stato anche capace di riprogrammare fibroblasti del derma adulto a uno stato di cellule pluripotenti48. In maniera simile, al Genome Center del Wisconsin linee di cellule staminali pluripotenti indotte sono state derivate da cellule somatiche umane riprogrammando il nucleo delle cellule somatiche a uno stadio di minor differenziazione49. Risultati simili sono stati ottenuti dall’interazione tra due gruppi dal Children’s Hospital di Boston e dal Dana Farber Cancer Institute di Boston50. Eliminate certe limitazioni tecniche (per esempio, la mutazione attraverso virus) questi risultati potrebbero permettere l’utilizzo di cellule staminali senza gli svantaggi legati alle tecniche necessarie al prelievo di midollo dal paziente stesso.

In alternativa alla riprogrammazione di cellule somatiche, risultati incoraggianti sono stati ottenuti verso l’istituzione di banche di cellule iPS che presentano tipi diversi di antigeni leucocitari umani (HLA). Questa collaborazione tra le università di Kyoto e di Gifu ha dimostrato la possibilità di utilizzare cellule della polpa dentale (DPCs) come fonte per l’istituzione di banche di cellule iPS che si stima possano coprire circa il 20% della popolazione giapponese51.

La possibilità di istituire banche di linee di cellule staminali umane pluripotenti (hPSC) suddivise per tipo di HLA potrebbe migliorare il rapporto efficacia/prezzo e l’attuabilità dei diversi sistemi di terapia cellulare in medicina e odontoiatria unitamente a una maggiore sicurezza e possibilità di controllo di tali terapie.

Conclusioni

Molti sforzi sono stati diretti nella ricerca di strategie rigenerative più veloci, più efficaci e maggiormente predicibili. Un gran volume di letteratura è stato pubblicato sull’uso discaffolds e recentemente anche tecniche utilizzanti fattori di crescita e terapie cellularisono state valutate. Tecniche di terapia cellulare hanno dimostrato un ottimo potenziale nella rigenerazione di nuovi tessuti. L’uso di cellule staminali mesenchimali autologhe è sicuro ed è stato studiato a fondo; questa metodica costituisce perciò la più promettente linea di ricerca per il prossimo futuro. In ogni modo, molti studi hanno suggerito che nuove fonti di cellule staminali potrebbero aprire la porta verso interessanti linee di ricerca.

Sebbene le terapie cellulari abbiano innumerevoli possibili applicazioni e saranno sicuramente sempre di più utilizzate nel trattamento di molte patologie mediche e odontoiatriche, sembra che sia necessario unire gli sforzi verso una linea di ricerca unificata diretta al trattamento di pazienti con metodologie e materiali standardizzati in modo da poter giustificare con un adeguato supporto della letteratura scientifica l’integrazione delle terapie cellulari nella pratica clinica.

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